VeriFi® Library Amplification Mix は、NGS ワークフローや困難な PCR に最適です。強力で堅牢な校正酵素、大幅に低減された GC 依存のバイアス、および AptaLock™ ホット スタート テクノロジーを組み合わせたこのミックスにより、シーケンシングするターゲットに関係なく、正確な PCR が可能になります。

VeriFi® Library Amplification Mix は、次世代シーケンシング (NGS) 研究を行う研究者のためのツールとして作成されました。PCR ベースの NGS ワークフローの重要な部分は増幅ステップです。このステップでは、DNA または cDNA (RNA-Seq 研究の場合) ライブラリが、目的のシーケンス プラットフォームに適したアダプターを含むように変更されており、シーケンス ステップに進む前に増幅する必要があります。

最終的なシーケンス データの精度を確保するには、NGS パイプラインの増幅ステップで使用される校正ポリメラーゼが、次のような重要な特性を備えている必要があります。

• ヌクレオチド取り込みにおける PCR エラーを最小限に抑えるための高い忠実度
• 強力なマルチプレックス機能により、ライブラリ内のさまざまな長さのフラグメントを増幅
• 特に複雑な (GC/AT がリッチな、または反復的な) シーケンスを扱う場合、シーケンス依存性のバイアスが低い

追加の機能は、実施される NGS 研究の種類に応じて、ライブラリー増幅ミックスのパフォーマンスを向上させるのにも役立ちます。VeriFi® Library Amplification Mix は、これらの機能を念頭に置いて設計されています。これは、市場をリードするPCR Biosystems 社の VeriFi® Polymerase と AptaLock™ ホット スタート テクノロジーを新しい 2x ミックス形式で搭載しています。このミックスには、反応バッファー、dNTP、Mg²⁺、および GC バイアスを最小限に抑え、Illumina® シーケンシング プラットフォームでの信頼できるライブラリー増幅を可能にするエンハンサーが含まれています。増幅されたライブラリは、シーケンシングの前に NGSBIO Library Quant Kit Blue for Illumina® を使用して簡単に定量化できます。

VeriFi® Library Amplification Mix は、市場をリードする競合他社 3 社とのブラインド比較において、Illumina® ベースのシーケンシングを使用して外部検証されました。VeriFi® Library Amplification Mix は、3 つの異なる微生物ゲノムについて、競合他社よりも一貫して 2% 多く独自にマッピングされたリードを提供しました。使用するシーケンス プラットフォームに応じて、この小さな割合は、80,000 ～ 100,000,000 個以上のユニークなリードに換算される可能性があります。これにより、ターゲット シーケンスのカバレッジが拡大し、定量的情報がより正確になるため、シーケンシング実験のコスト効率が向上し、結果のデータがより有益になります。

新しいバッファー組成により、VeriFi® Library Amplification Mix は複雑なテンプレートに最適です。当社の研究チームは、この酵素を数多くの難しいテンプレートの PCR で試し、30% ～ 70% の GC 含有量の極端な値で増幅中にバイアスが最小限に抑えられることを実証しました。すべての主要な競合製品よりも一貫して優れたパフォーマンスを実現したこれらの結果は、ターゲット配列に関係なくミックスの最先端のパフォーマンスを保証し、コストと労力のかかる NGS 実験を行う際に自信を与えます。前述のより多数のユニーク リードと組み合わせることで、この機能により VeriFi® Library Amplification Mix はメタゲノム解析の実施に最適です。

VeriFi® Library Amplification Mix は、PCRBIO の革新的な AptaLock™ ホット スタート テクノロジーによって強化されています。これは、周囲温度で酵素の 3’-5’ エキソヌクレアーゼ活性と 5’-3’ ポリメラーゼ活性の両方を可逆的に阻害する独自のアプタマー様分子です。この独自のホット スタート分子は、プライマー ダイマー形成と非特異的増幅を防ぎ、PCR の感度と特異性を最大限に高めます。これにより、増幅反応を室温で設定できるようになります。

平均 GC 含有量が異なる 3 つの微生物ゲノム (E. coli ~50% GC、S. aureus ~30% GC、および S. griseus ~70% GC) について、ユニークにマッピングされたリード数を 4 つのシーケンス データ セットの合計リード数に対するパーセンテージで示しています。データセットは、ブラインド実験で Illumina® シーケンスを使用してセグメント化されました。この実験では、3 つのゲノム ライブラリすべてが、VeriFi® Library Amplification Mix (ピンク)、KAOA HiFi HotStar Library Amplification Kit (緑)、NEBNext® Ultra™ II Q5® Master Mix (オレンジ)、および Takara SeqAmp™ DNA Polymerase (青) という異なるプルーフリーディング ポリメラーゼを使用して増幅されました。VeriFi® Library Amplification Mix を使用した NGS ライブラリ増幅では、主要な競合製品と比較して、リード重複排除後のデータセットあたりのユニーク リード数が多くなります。

NGS は、異なる GC 含有量間隔 (E. cooil ~50% GC、S. aureus ~30% GC、および S. griseus ~70% GC) でのリファレンスゲノムの読み取りカバレッジを正規化しました。NGS ライブラリは、NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit for Illumina® を使用して調製し、メーカーの指示に従って、異なる混合物のそれぞれを使用して PCR 増幅ステップを実行しました。データセットは、ブラインド実験 (対応するライブラリ増幅にどのミックスが使用されたかを知らせずにシーケンスとデータ分析を実行) で Illumina® シーケンシングを使用して生成されました。読み取りカバレッジは、テストしたすべてのミックスで同様です。

GC 含有量が異なる合成 1 kb 配列の増幅。灰色: 30% GC、紫: 50% GC、青: 70% GC。増幅曲線は左のパネルに、融解ピークは右のパネルに示されています。各テンプレートの連続希釈液は、20 µL の反応容量で使用されました。テストされたミックスは、A) VeriFi® Library Amplification Mix、B) KAPA HiFi HotStart Library Amplification Kit、C) NEBNext® Ultra™ II Q5® Master Mix、D) RepliQa HiFi PCR Master Mix (Quantabio)、E) Platinum SperiFi II DNA ポリメラーゼ (Thermo)、および F) PrimeStar GXL DNA ポリメラーゼ (Takara) です。各ミックスは、メーカーが推奨するサイクリング条件下で実行されました。VeriFi® Library Amplification Mix は、競合他社よりもバイアスがはるかに少なく、幅広い GC 含有量と幅広い濃度にわたってテンプレートを一貫して増幅します。

異なる GC 含有量の合成 1 kb 配列の増幅。灰色: 30% GC、紫: 50% GC、青: 70% GC。増幅曲線は左のパネルに、融解ピークは右のパネルに示されています。各テンプレートの連続希釈液は、20 µL の反応容量で使用されました。テストされたミックスは、A) VeriFi® Library Amplification Mix、B) PrimeStar GXL DNA ポリメラーゼ (Takara)、C) Equinox® Library Amplification Kit (Watchmaker Genomics)、D) RepliQa HiFi PCR Master Mix (Quantabio)、E) SimpliFi HS Mix (Meridian)、および F) GC 最適化されていない VeriFi® Polymerase (ベースライン パフォーマンス) です。各ミックスは、メーカーが推奨するサイクリング条件下で実行されました。VeriFi® Library Amplification Mix は、競合他社よりもバイアスがはるかに少なく、幅広い GC 含有量と幅広い濃度にわたってテンプレートを一貫して増幅します。

VeriFi® Library Amplification Mix

VeriFi® Library Amplification Mix を使用してマルチプレックス PCR を行うことはできますか？

はい。ほとんどのマルチプレックス実験では、VeriFi^® Hot Start Polymerase & Mixes の使用をお勧めします。ただし、特にマルチプレックス ターゲットの 1 つ以上が GC に富んでいるか、困難な配列領域や反復配列領域を含む場合は、VeriFi® Library Amplification Mix もこの目的に適しています。

VeriFi® Library Amplification Mix を亜硫酸水素塩処理 DNA のメチル化研究/増幅に使用できますか？

いいえ。Pfu ポリメラーゼは突然変異誘発後にウラシルを含むターゲットのみを増幅できるため、PCR の忠実度が損なわれます。

ライブラリ増幅ではなく標準 PCR に VeriFi® Library Amplification Mix を使用できますか？

はい。製品マニュアルの関連する手順に従ってください。VeriFi® Library Amplification Mix は、標準の 3 ステップまたは 2 ステップのサイクリング プログラムで使用でき、GC 含有量が非常に高いか非常に低いターゲットの増幅に特に適しています。

VeriFi® Library Amplification Mix はシングルセル NGS に使用できますか？

VeriFi® Library Amplification Mix は、あらゆるタイプの DNA シーケンス ライブラリの PCR ベースの濃縮に使用できます。

VeriFi® Library Amplification Mix を使用したアダプターライゲーションとライブラリ増幅の間に精製ステップを含める必要がありますか？

アダプターのライゲーションとサイズ選択の後に精製ステップを組み込むことをお勧めします。これにより、バッファーの不適合の可能性が排除され、ライゲーションされていないアダプターがライブラリ PCR エンリッチメント中に増幅されないことが保証されます。

GC 含有量の高いターゲットを増幅するのに苦労しています。どうすればよいでしょうか？

変性温度を 98 ～ 100 °C に上げ、伸長時間を延長してみてください。

増幅したライブラリの品質が悪いのですが、どうすれば改善できますか？

変性温度を上げます。アニーリング温度と伸長時間を最適化します。反応中のプライマーとテンプレートの量を最適化します。開始材料が高品質であることを確認してください。

VeriFi® Library Amplification Mix を使用して増幅できるターゲットの最大長はどれくらいですか？

GC リッチ領域を含む 12 kb のフラグメントの増幅に成功しました。より長いターゲットも成功する可能性があります。

VeriFi® Library Amplification Mix を使用してライブラリ増幅を成功させるために使用できるテンプレートの最小量はどれくらいですか？

NGS ライブラリの増幅には 10 ng 未満のテンプレートを使用しないでください。高品質の増幅ライブラリを取得するための重要な要素は、使用する PCR サイクル数を制限することです。サイクル数が多いと、PCR によるエラーやバイアスが発生する可能性が高くなります。

VeriFi® Library Amplification Mix はどの NGS シーケンス プラットフォームで使用できますか？

VeriFi® Library Amplification Mix は、P5 および P7 Illumina® プライマーを使用した Illumina® シーケンシング プラットフォームで広範囲にテストおよび検証されています。このミックスは、他のシーケンシング プラットフォーム (Pac Bio や Oxford Nanopore Technologies など) で使用することを目的とした、異なるアダプター シーケンスを持つライブラリの増幅でも同様に機能するはずですが、テストが必要です。