VeriFi® Library Amplification Mix を使用してメタゲノム解析を実行すべき理由
Constantine Garagounis, PhD
メタゲノム解析とは？
メタゲノム解析では、環境サンプルや臨床サンプル、またはマイクロバイオーム（複数の微生物種）を含むその他のサンプルタイプから直接収集された遺伝物質の解析が行われます。このようなサンプルの例としては、人間の腸、口腔、廃水、土壌サンプルなどが挙げられます。このタイプの研究は、これらのサンプルに存在する微生物群集の構造、機能、多様性を、それらの集合的な遺伝物質を調べることによって理解することを目的としています。従来の微生物学の方法では、サンプル内の微生物のサブセット（実験室条件下で培養できる生物のみ）しか検出できません。メタゲノム解析（複雑な微生物サンプルに対するNGS（次世代シーケンシング）の使用）は、環境サンプルからDNAまたはRNAを直接抽出してシーケンシングすることでこの制限を克服し、微生物群集全体の遺伝内容のスナップショットを提供します。
VeriFi® Library Amplification Mix がメタゲノム解析に最適なのはなぜですか？
外部テスターによるブラインド実験において、VeriFi® Library Amplification Mix は、他の専用ライブラリー増幅ミックスである KAPA HiFi HotStart Library Amplification Kit、NEBNext Ultra II Q5 Master Mix、Takara SeqAmp DNA Polymerase と比較して、3 つの異なる微生物ゲノムにおいて重複排除リード数が 2% 増加 (または重複リード数が 2% 減少) しました (図 1)。使用するシーケンス プラットフォームに応じて、データセットごとに 80,000 ～ 2,500 万件多いユニーク リード数に相当します。
図１：データセットあたりのユニークリード数の増加
平均 GC 含量が異なる 3 つの微生物ゲノム (大腸菌 GC 〜 50%、黄色ブドウ球菌 GC 〜 30%、および S. グリセウス GC 〜 70%) について独自にマッピングされたリード数を、4 つのシーケンシング データセットの合計リードの割合として示します。データセットは、ブラインド実験で Illumina® シーケンシングを使用して生成されました。この実験では、3 つのゲノム ライブラリーすべてが、VeriFi® Libary Amplification Mix (紫色)、KAPA HiFi HotStart Library Amplification Kit (緑色)、NEBNext Ultra II Q5 Master Mix (オレンジ色)、およびTakara SeqAmp DNA Polymerase (青色) の異なる校正ポリメラーゼで増幅されました。
VeriFi® Libary Amplification Mix を使用した NGS ライブラリ増幅により、主要な競合他社と比較して、読み取りの重複後のデータセットあたりの一意の読み取り数が増加します。
さらに、このミックスは、テストしたどの競合ミックスよりも GC バイアスが明らかに低いことが示されています (他の 5 種類以上のミックスとの比較、図 2)。
図２：VeriFi® Library Amplification Mix の GC バイアスの削減
GC 含有量が異なる合成 1 kb 配列の増幅。灰色: 30% GC、紫: 50% GC、青: 70% GC。増幅曲線は左のパネルに、融解ピークは右のパネルに示されています。各テンプレートの連続希釈液は、20 µL の反応容量で使用されました。テストされたミックスは、A) VeriFi® Libary Amplification Mix、B) KAPA HiFi HotStart Library Amplification Kit、C) NEBNext Ultra II Q5 Master Mix、D) RepliQa HiFi PCR Master Mix (Quantabio)、E) Platinum SperiFi II DNA ポリメラーゼ (Thermo)、および F) PrimeStar GXL DNA ポリメラーゼ (Takara) です。各ミックスは、メーカーが推奨するサイクリング条件下で実行されました。
VeriFi® Libary Amplification Mix は、競合他社よりもバイアスがはるかに少なく、幅広い GC 含有量と幅広い濃度にわたってテンプレートを一貫して増幅します。
VeriFi® Library Amplification Mix を使用することの主なメリット
- より信頼性の高い結論を得るための質の高いデータ
- 統計的検出力の向上による比較分析の強化
- コスト効率が向上 – 競合他社のキットと比較して、実験あたりの情報量が多い
メタゲノム解析において NGS データセットでリード重複を減らすことが重要な理由[1]
信頼性の高い存在量推定
重複した読み取りにより、微生物分類群の存在量の推定値が歪む可能性があります。特定の DNA フラグメントが重複により過剰に存在すると、対応する生物または遺伝子の存在量が人為的に増大します。これにより、微生物群集内のさまざまな分類群または機能遺伝子の相対的な存在量と重要性について誤った結論につながる可能性があります。重複した読み取りを減らすことで、研究者は微生物存在量のより信頼性の高い推定値を得ることができます。
統計力の強化
メタゲノム解析では、異なるサンプルや条件間の統計的比較が頻繁に行われます。重複読み取りが多いとバイアスが生じ、これらの解析の統計的検出力が低下する可能性があります。重複を最小限に抑えることで、研究者は統計テストの精度を向上させ、サンプル間の意味のある違いを検出する能力を高めることができます。
コストパフォーマンス
メタゲノムデータのシーケンスと分析は、時間とリソースの両面でコストがかかる可能性があります。重複した読み取りは、貴重な情報を追加することなく、不必要なシーケンス処理能力と計算リソースを消費します。重複を減らすことで、シーケンス作業を最適化し、コストを節約してデータ分析をより効率的に行うことができます。
メタゲノムデータの品質を向上させる主な機能
- ライブラリ増幅ステップ中のGCバイアスの低減
- GC 含有量の影響を受けないゲノムカバレッジ
- 最終的なNGSデータセットにおける重複読み取り数の削減
GCバイアスを減らすとメタゲノム解析が改善される理由[2]
微生物の多様性を正確に表現
GC バイアスとは、特定の GC 含有量を持つ DNA フラグメントが優先的に増幅または配列決定されることを指します。特定の GC 含有量の範囲に大きな偏りがある場合、サンプル内の微生物の多様性が不正確に表現される可能性があります。一部の微生物分類群は過剰に表現される一方で、他の分類群は過小に表現される可能性があり、微生物群集の相対的な存在量と構成が歪められます。GC バイアスを最小限に抑えることで、微生物の多様性をより正確かつ偏りなく表現できるようになります。
改善された分類学的および機能的プロファイリング
GC バイアスは、メタゲノム データの分類学的および機能的プロファイリングの精度に影響を与える可能性があります。特定の GC 含有量範囲が過剰に表れると、微生物分類群の誤った識別や誤分類につながる可能性があります。同様に、特定の GC 含有量範囲に関連する機能遺伝子が不均衡に表れると、偏った機能的プロファイリングにつながる可能性があります。GC バイアスを減らすことで、研究者は分類学的および機能的割り当ての信頼性と精度を向上させ、より堅牢な生物学的解釈が可能になります。
比較解析の強化
メタゲノム解析では、複数のサンプルや条件を比較することがよくあります。GC バイアスにより、読み取り範囲と存在量の推定に体系的な違いが生じる可能性があり、正確で意味のある比較を実行することが困難になります。GC バイアスを最小限に抑えると、偏った増幅やシーケンスによってもたらされる変動が軽減され、さまざまなサンプルの比較可能性が向上し、より信頼性の高い統計分析が可能になります。
下流分析の改善
GC バイアスは、アセンブリ、遺伝子予測、経路再構築などの下流の解析に影響を及ぼす可能性があります。GC バイアスに起因する偏ったカバレッジと不正確な存在量推定は、これらの分析の精度と信頼性に影響を与える可能性があります。したがって、GC バイアスの低減により、下流の分析出力の品質が向上し、メタゲノム データから得られる生物学的洞察の信頼性が高まります。
まとめ
VeriFi® Libary Amplification Mix は、GC バイアスを低減し、より効率的な多重化を可能にすることで、より高品質なライブラリーの調製を容易にします。これにより、メタゲノム解析によって微生物群集に関する正確で有意義な洞察が得られるようになります。
References
- Nayfach S, Pollard KS. Toward Accurate and Quantitative Comparative Metagenomics. Cell. 2016 Aug 25;166(5):1103-1116. doi: 10.1016/j. cell.2016.08.007. PMID: 27565341; PMCID: PMC5080976.
- Patrick D B, Nielsen T K, Kot W, Aggerholm A, Gilbert M T P, Puetz L, Rasmussen M, Zervas A, Hansen L H, GC bias affects genomic and metagenomic reconstructions, underrepresenting GC-poor organisms, GigaScience, Volume 9, Issue 2, February 2020, giaa008, doi: 10.1093/gigascience/giaa008