シングルセルRNAシーケンス前処理キット
HIVE CLX™ scRNAseq Solution
HIVE CLX™ scRNAseq Solutionの特長 免疫細胞を凍結保存すると多くの細胞が破壊されてしまいます。
長期間の凍結保存(20wk-Cryo)ではT細胞(T cells)、単球(Mo)、マクロファージ(Ma)のほとんどが破壊されていました。
HIVE CLX™ を使用すると長期保存(9か月)でもサンプルのロスを極めて低く抑えることができます。
HIVE CLX™について
HIVE scRNAseq とは何ですか？
HIVE scRNAseqは、シングルセルRNAプロファイリングのための包括的なソリューションを提供し、シングルセルをシーケンス対応のNGSライブラリに変換します。HIVEは、ポータブルでハンドヘルドな使い捨てデバイスであり、シングルセルサンプルの解析において、細胞への優しいキャプチャ、容易な保管、そしてスケーラブルな処理を可能にします。
HIVE の特徴的な機能をいくつか紹介します。
一体型サンプルストレージ
分散キャプチャおよび集中処理
大きなサンプルロード容量
脆弱な細胞の回復
柔軟で拡張性のあるワークフロー
強力な溶解液
HIVE を使い始めるにはどうすればいいですか？
開始するには、HIVE Complete Bundle、HIVE Open Source、および HIVE Service の 3 つのオプションが提供されます。
HIVE Complete Bundle
HIVE Complete Bundle には、サンプルのキャプチャ、トランスクリプトームの回復、ライブラリの準備のための部品と試薬が含まれています。これにより、研究者はサンプルをロードし、シーケンシングの準備ができたライブラリを生成できます。また、BeeNet解析ソフトウェアも提供しています。
HIVE Open Source Bundle
HIVE Open Source Bundle には、サンプルのキャプチャとトランスクリプトームの回復のための部品と試薬が含まれています。研究者は独自のライブラリ調製試薬とプロトコルを使用できます。
HIVE Service
HIVE Service では、研究者がサンプルを採取し、Honeycomb 社に送付して処理・解析を行うことができます。これは、NGSの経験が浅い研究者にとって、最も簡単に始めることができる方法です。
サービスは提供していますか？
はい、HIVE処理をご自身で行いたくない方のために、オプションとしてHIVE Service をご提供しています。サンプルをロードしていただければ、処理、シーケンス、データ解析はHoneycomb 社にお任せください。新規ユーザー、パイロット、そして難しいサンプルを扱う方に最適です。詳しくはこちらをクリック
トレーニングにはどのような教材が利用できますか？
初めて使用するユーザーは、実際のサンプルを使用する前に、付属のデモ パーツ キットで練習することをお勧めします。
細胞の操作に慣れていないユーザーは、Cell Surrogates を使用して、細胞のカウントと HIVE Collector へのロードを練習できます。
トレーニング セッションをセットアップするには、弊社までお問い合わせ
HIVE CLX と HIVE v1 の違いは何ですか？
HIVE v1 からの改良点：
４倍以上の細胞を回収
ワークフローと使いやすさの向上
遺伝子と転写産物が20%増加（化学反応の改善による）
プロトコルはどこからダウンロードできますか？
書面およびビデオのプロトコルをダウンロードするには、サポート ページ
サンプル調整について
サンプル調整に HIVE 固有の要件はありますか？
対象となるサンプルの種類に応じて、最適なサンプル調製条件を推奨します。HIVE CLXの場合、最終的な細胞懸濁液は、少なくとも1%のFBSまたは0.1%のBSAを含む培地で調製する必要があります。
シングルセル懸濁液に塊がある場合はどうすればいいですか?？
塊が心配な場合は、HIVE にロードする前に、サンプルを 70µm セル ストレーナーで濾過することができます。
細胞をロードした後の洗浄ステップは、HIVE の 60µm ウェルに収まらない大きな塊や破片を除去するのに役立ちます。
細胞生存率はどのくらい低くなるのでしょうか？
細胞生存率90%以上を目指すことをお勧めします。サンプルの品質が良ければ良いほど、データの品質は向上します。生存率70%のサンプルでも、製品仕様との差は15%以内です。
赤血球を除去するための推奨プロトコルはありますか？
血液からの赤血球除去には、 EasySep™ RBC Depletion Reagent EasySep™ Magnet
サンプルキャプチャについて
HIVE コレクターの有効期限はどれくらいですか？
HIVE は現在、-20℃ で保管した場合、受領後最大 ３６ か月の保存期間があることが確認されています。
HIVE コレクターを解凍する別の方法はありますか？
はい、4℃で一晩解凍するのは、室温で30分間解凍するのと同様です。
細胞をロードする前に、HIVE コレクターを室温にどれくらい置くことができますか？
1時間です。1時間を超える場合は4℃に移動させてください。
HIVE あたり何個の細胞をロードできますか？
HIVE v1 scRNAseqの場合：
HIVE あたり 15,000 個の細胞をロードすることをお勧めします
ロード範囲は HIVE あたり細胞 500 ～ 30,000 個です
HIVE CLX scRNAseqの場合：
HIVE あたり 30,000 個の細胞をロードすることをお勧めします
ロード範囲は HIVE あたり細胞 500 ～ 60,000 個です
カウントする際は、サンプル内の生細胞の数に基づいてロードしてください。
サンプルロード量はどれくらいですか？
標準的なローディング方法は、サンプル 1 mL です (1 mL のサンプルが手に入らない場合は、残りの容量をローディング バッファーで補います)。
HIVEコレクターの容量は4mLです。
容量が 4mL を超える場合は、スピン プロトコルを使用して、各スピンの後に上清を除去し、連続的にロードします。
どのような種類のサンプルを使用できますか？
HIVE scRNAseq は、3′ ポリ A テールを持つ mRNA 転写物を含む真核細胞に使用できます。ウェルに収まるためには、細胞の大きさは55µm未満である必要があります。私たちは、ヒト濾過血液、PBMC、マウス脾臓細胞など、様々な哺乳類細胞種で試験を行ってきました。
使い捨て血球計数器の代わりに自動セルカウンターを使用できますか？
はい、可能です。ただし、まず血球計数器との比較を行い、細胞カウンターの精度を確認することをお勧めします。Nexcelom K2 Cellometer
細胞をロードする前にどのような種類の培地に懸濁すればよいですか？
HIVEは幅広いサンプルバッファーに対応しています。タンパク質濃度は0.1%程度を推奨しますが、FBS濃度は10%まで可能です。最適な細胞回収率を得るには、PBS + 0.1% BSAを細胞ローディングに使用することをお勧めします。HIVE CLXの場合、最終的な細胞懸濁液は、少なくとも1% FBSまたは0.1% BSAを含む培地で調製する必要があります。タンパク質濃度が1%を超える場合は、追加の洗浄をお勧めします。
各ウェルに 1 つの細胞だけが入るようにするにはどうすればよいでしょうか？
アレイは細胞を捕捉するピコウェルで構成されています。細胞捕捉はポアソン分布に従います。より多くの細胞をロードすると単一細胞の回収率が向上する一方で、ダブレット形成率も向上します。HIVE CLXアレイはHIVE v1よりも多くのピコウェルを備えており、細胞ロード容量と単一細胞の解像度が向上しています。
ダブレット率とは何ですか？
次の表は、ロードされた細胞の数に基づいて、ポアソン ロードの理論的なマルチプレート レート (%) を示しています。
保管と発送について
細胞をロードした HIVE は -20℃ でどのくらいの期間保存できますか？
HIVE v1は現在、-20℃で最大9か月の保管が検証されており、HIVE CLXは現在最大3か月の保管が検証されています。より長期の保管期間に関する試験は現在進行中です。
細胞をロードしたHIVEはどのように保管すればよいですか？
細胞をロードした HIVE は凍結する必要があります。細胞がロードされた HIVE を -80℃ で保管することは、-20℃ で保管する場合と同様です。
細胞をロードした HIVE を保存せずに、サンプルキャプチャから処理に直接進むことはできますか？
はい、サンプルキャプチャ後に停止しない場合は、処理プロトコルを開始する前に、細胞をロードした HIVE を細胞保存溶液で 30 分間インキュベートしてください。
細胞をロードしたHIVEをドライアイスと一緒に発送する必要があるのはなぜですか？
細胞保存液は-20℃では完全に凍結しません。細胞をロードしたHIVEは、輸送前に完全に凍結（平らな状態で）する必要があります。
送られてきた細胞がロードされた HIVE はどのように保管すればよいですか？
ドライアイスで輸送された細胞がロードされたHIVEを受領後、処理まで-80℃で保管することをお勧めします。詳細については、サンプルローディングプロトコルの受領手順をご覧ください。
HIVE の処理とライブラリの準備について
一度にいくつのサンプルを処理できますか？ また、処理にはどのくらいの時間がかかりますか？
各サンプルが独立しているため、私たちのワークフローは高い柔軟性を提供します。通常の状況では、1 ～ 24 個のサンプルを並行して処理でき、1.5 日以内に処理してシーケンスの準備が整います。
HIVE からビーズが正常に回収されたことを確認するにはどうすればよいですか？
遠心分離後、ビーズコレクターの底に白いペレットが確認できます（スピンプレートを頭上に持ち上げるとより見やすくなります）。300μl を採取している間、ピペットチップ内にビーズが存在し、溶液は濁って見えます。その後、ペレットは見えなくなります。
棒磁石の代わりに円形 96 ウェル プレート磁石を使用できますか？
使いやすさを考慮して棒磁石をお勧めしますが、以前に SPRI のクリーンアップに使用した経験がある場合は、他の磁石も使用できます。
使用済みの HIVE 部品はどのように処分すればよいですか？
使用済みの HIVE 部品は、非鋭利物として標準的なバイオセーフティ廃棄物として処分できます。
HIVE 溶解溶液は感染症サンプルを不活化できますか？
この溶解溶液は、SARS-CoV-2 に感染したヒト全血を不活化することが示されていますが、特定のサンプルを検査することをお勧めします。
Lysis Solution Data
QC、プーリング、シーケンスについて
どのようなシーケンス プラットフォームをお勧めしますか？
HIVE scRNAseqライブラリは現在、カスタムデュアルインデックスペアエンドシーケンスが可能なIlluminaシーケンシングプラットフォームと互換性があります。NovaSeq、NextSeq 2000、またはNextSeq500/550を推奨します。
カスタムシーケンシングおよびインデックスプライマーは、ライブラリ調製試薬とともに提供されます。
各 HIVE に必要な読み取り数はいくつですか？
必要な読み取り数は、細胞の数、アプリケーション、データ品質、サンプルの種類によって異なります。
どのシーケンスキットをお勧めしますか？
NextSeq 500/550 – 75 High Output cycle kit
NextSeq 2000- 100 cycle kit
NovaSeq 6000 – 100 cycle kit
推奨されるシーケンス設定は何ですか？
カスタム シーケンス プライマーを使用したデュアル インデックス付きペアエンド シーケンス
R1: 25 R2: 50 I1: 8 I2: 8
ユーザー処理プロトコルの付録では、シーケンスのセットアップについて詳しく説明します。
シーケンスの品質を確認するにはどうすればいいですか？
塩基品質指標は、シーケンス技術の精度を評価するために使用されます。イルミナは、塩基品質を評価するための2つの指標を提供しています。%PF （イルミナのプリセットフィルターを通過するクラスターの割合）と%QC30 （品質スコアが30以上の塩基の割合）です。
FastQC はシーケンス データを評価するために使用できます。FastQC は、バブラハム研究所で開発されたハイスループットのシーケンス データ用のオープンソースの品質管理ツールです。詳細情報とダウンロードは以下をご覧ください。
https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc
サンプルをデマルチプレックスするにはどうすればいいですか？
青色のCDIインデックスプレートを使用し、すべてのインデックスがインデックスプレートの同じ列（例：A1-H1）から取得されている場合は、インデックス2のリードが同一となるため、インデックス1のリードのみに基づいてサンプルをデマルチプレックスしてください。インデックスが複数の列から取得されている場合、または透明のUDIインデックスプレートを使用している場合は、インデックス1とインデックス2のリードに基づいてデマルチプレックスしてください。
シーケンスを設定する場合、どのフラグメント サイズを使用すればよいですか？
イルミナシーケンサーにロードする際、HIVEライブラリのモル濃度を計算する際には、フラグメントアナライザーで異なるピークサイズが表示された場合でも、公称フラグメントサイズ750 bpを使用することをお勧めします。この情報をシーケンシング施設にご提供ください。
ソフトウェアと解析について
どのような解析ソフトが提供されていますか？
BeeNet™は、HIVE scRNAseq向けに特別に設計されたソフトウェアソリューションです。また、Terraユーザーには、エンドツーエンドの解析を可能にするBeeNetPLUSワークフローも提供しています。
BeeNetとBeeNetPLUSの違いは何ですか？
BeeNet
BeeNet は、Linux コマンド ラインを介してクラスターまたはクラウドにダウンロードして使用できます。入力ファイルはデマルチプレックスされたFastQファイルで、出力は二次分析に使用できるカウントマトリックスと追加のQCファイルです。
BeeNetPLUS
BeeNetPLUSはGUIインターフェースで、Terraでホストされています。入力はデマルチプレックスされたFastQファイルで、出力はデータの簡単な分析結果を含むHTMLファイルと、BeeNetの標準出力ファイルです。
どうすればソフトウェアにアクセスして使用できますか？
インストールと分析の手順についてはサポート ページ
BeeNet は、Linux コマンドライン経由でクラスターまたはクラウドにダウンロードして使用できます。
また、コマンドライン経験のないユーザー向けに、Terra で BeeNetPLUS をホストしています。
サンプルデータをダウンロードできますか？
はい、データはこちらから
BeeNet 解析ソフトウェアの入力ファイルは何ですか？
Illumina ペアエンド シーケンスからのデマルチプレックスされた Read 1 および Read 2 FASTQ ファイルです。
ヒトのどのリファレンスゲノムを使用しますか？
hg19 と GRhC38 の両方をご利用いただけます。
独自のリファレンスを使用できますか？
使用したいリファレンスがあり、それが BeeNet で入手できない場合はお問い合わせ
毎回リファレンスをダウンロードする必要がありますか？
リファレンスをすでにダウンロードしていて、同じシステムでまだ利用できる場合は、再度ダウンロードする必要はありません。
BAM ファイルにはマッピング品質情報が含まれていますか？
はい、そうです。ただし、BAM ファイルには分子数情報は含まれていません。
イントロン領域にアノテーションを付けますか？
BAM ファイルではイントロン領域にアノテーションが付けられますが、分子数には含まれません。
BeeNet が生成するファイルの種類は何ですか？
BeeNet は、BAM、カウント マトリックス、品質メトリックの 3 種類のファイルを生成します。
ハニカムバイオテクノロジー社のHPをご参照ください
下記の2社では、当該キットを用いた受託解析に対応しております。
