qPCRBIO SyGreen® Mix

qPCRBIO SyGreen® Mix は、独自の非阻害インターカレーション色素とポリメラーゼ技術およびバッファー化学の最新の進歩を組み合わせて、高速、高感度、再現性のある色素ベースのリアルタイム qPCR を実現します。

qPCRBIO SyGreen® Mix は、染料ベースの qPCR を使用してゲノム、cDNA、ウイルス配列を含むあらゆる DNA テンプレートを確実に定量化するために使用でき、極めて低いコピー数のターゲットを最高の効率で検出できます。

アプリケーション

• 絶対的な定量化
• 相対的遺伝子発現解析
• ゲノム、cDNA、ウイルス配列からのハイスループット qPCR
• 極度にコピー数の少ないターゲットの検出
• 粗サンプル PCR

qPCRBIO SyGreen® Mix とは？

qPCRBIO SyGreen® Mix は、最適化を最小限またはまったく必要とせず、高速、高感度、再現性のある色素ベースのリアルタイム qPCR 用に設計されています。抗体媒介ホット スタート システムにより、プライマー ダイマーや非特異的な生成物の形成が防止され、反応の感度と特異性が大幅に向上します。

PCR Biosytems 社の 2x ミックスでは、他の一般的な蛍光色素とは異なり、PCR を阻害しない独自の DNA インターカレーション色素を使用しています。標準サイクリング条件での qPCRBIO SyGreen® Mix の感度と一貫性を向上させるのと同じ開発により、高速および超高速サイクリング条件でも業界をリードするパフォーマンスを実現しています。

qPCR 選択ツールを使用して、どの ROX 変異体がお使いの機器と互換性があるかを調べることができます。

qPCRBIO SyGreen® はどのように機能しますか?

これらのインターカレーション色素は、約 3.5 ～ 4 ヌクレオチドにわたる二本鎖 DNA の副溝への分子のインターカレーションを可能にする芳香族基と平面基を持っています。存在する正の基は色素を安定化させ、負に帯電した DNA 骨格との調整を可能にします。

この DNA への結合メカニズムにより、二次構造が形成されない限り、一本鎖核酸に結合することはできません。一方、dsDNA に挿入されると蛍光は最大 1,000 倍に増加します。

色素が DNA 塩基対の間に挿入されると、結合した色素の量 (したがってサンプル中の DNA の量) に比例して蛍光を発します。これにより、ゲル上またはリアルタイム qPCR 機器の蛍光計で核酸を視覚化できます。後者の場合、サンプル内の挿入された染料分子の数は qPCR の進行とともに増加し、各サイクルでそれに応じて蛍光が増加します。反応の開始時に、遊離染料は基本レベルの蛍光を発します。反応が進むにつれて、蛍光強度は指数関数的に増加し、後のサイクルで横ばいになり、典型的なシグモイド増幅プロットになります。

色素ベースの qPCR のメリットと限界

メリット：多用途のターゲット検出

SyGreen または SYBR Green タイプの染料をプライマーと組み合わせることで、研究者は任意のターゲット分子を検出できます。この多用途性により、高スループットのシングルプレックス qPCR をシンプルかつコスト効率よく設計できます。

メリット：可逆的な蛍光シグナル蓄積

DNA インターカレーション色素の使用により、蛍光シグナルの可逆的な蓄積が促進されます。強い蛍光はインターカレーション色素からのみ発生するため、DNA の変性により蛍光シグナルが減少します。この特性により、融解曲線分析による特異性テストが可能になり、qPCR 特異性の迅速な評価が可能になります。

限界：非特異的シグナルの生成

インターカレーション色素は、反応チューブ内に存在する dsDNA 分子に結合すると、非特異的蛍光シグナルを生成する可能性があります。これは、誤ったプライミング、サンプル内の類似配列の存在、プライマー二量体の形成、またはプライマーヘアピン構造の可能性によって発生する可能性があります。結果を検証するには、融解曲線分析、ゲル電気泳動、またはサンガー配列決定などの追加分析を実行する必要があります。

限界：単一ターゲットアッセイ

染料ベースの qPCR では、反応ごとに 1 つのターゲットのみをアッセイできます。サンプル内の複数のターゲットを定量化するには、対応する数の反応を設定する必要があります。

融解曲線分析

融解曲線分析は、qPCR 産物の融点を特定し、産物の特異性に関する貴重な洞察を提供するのに役立ちます。この分析には、qPCR サイクリング プログラムの最後に追加の熱サイクリング ステップが含まれます。このステップでは、インキュベーション温度を段階的に増加させながら、各温度間隔 (たとえば、0.1 ～ 0.5 ℃ ごと) で蛍光データを収集することで、反応サンプルを徐々に変性させます。温度に対して蛍光強度データをプロットすると、融解曲線が生成されます。特定の産物を含む反応では、温度がターゲットの融点に近づくまで蛍光は安定しており、その時点で急速にベースラインまで低下します。蛍光が最大値の 50% に低下する温度が、その分子の融点または Tm と見なされます。反応の特異性の評価は、dRFU/dT として知られる、温度変化 (dT) に対する蛍光強度の一次導関数 (-dRFU) をプロットすることで簡素化できます。特定の単一の生成物との反応の場合、生成物の Tm を中心とする放物線状のピーク（融解ピーク）が生成されます。

※ SYBR Green は Molecular Probes Inc. の登録商標であり、Thermo Fischer Scientific が所有しています。PCR Biosystems Ltd. はこれらの団体とは一切関係ありません。

参考データ１：ガンマ アクチンの増幅

qPCRBIO SyGreen® Mix を使用したガンマ アクチンの増幅 (紫色の曲線)。増幅曲線は上部パネルに、融解曲線は中央パネルに、増幅効率は下部パネルに示されています。上部パネルで特定された競合製品 (灰色の曲線) との直接的なオンプレート比較が実行されました。マウス cDNA テンプレートの 5 段階希釈が、総反応容量 10 µL で使用されました。サイクリング条件は、各競合製品が推奨する条件でした。qPCRBIO SyGreen® Mix は、すべての競合製品と比較して、Ct が早く、融解ピークがきれいで、効率が優れています。

参考データ２：ベータ アクチンの増幅

qPCRBIO SyGreen® Mix を使用したベータ アクチンの増幅 (紫色の曲線)。増幅曲線は上部パネルに、融解曲線は中央パネルに、増幅効率は下部パネルに示されています。上部パネルで特定された競合製品 (灰色の曲線) との直接的なオンプレート比較が実行されました。マウス cDNA テンプレートの 5 段階希釈が、総反応容量 10 µL で使用されました。サイクリング条件は、各競合製品が推奨する条件でした。qPCRBIO SyGreen® Mix は、すべての競合製品と比較して、Ct が早く、融解ピークがきれいで、効率が優れています。

参考データ３：ベータ 2 ミクログロブリンの増幅

qPCRBIO SyGreen® Mix を使用したベータ 2 ミクログロブリンの増幅 (紫色の曲線)。増幅曲線はセット a とセット b の上部パネルに示され、融解曲線は中央のパネルに示され、増幅の効率は下部パネルに示されます。各セットの上部パネル（灰色の曲線）で特定された競合製品と、プレート上で直接比較を行いました。マウス cDNA テンプレートの 5 段階希釈液が、総反応量 10 μL で使用されました。サイクリング条件は、各競合製品が推奨する条件でした。qPCRBIO SyGreen® Mix は、競合他社の各ミックスと比較して、Ct が早く、融解ピークがより鮮明で、効率が優れています。

製品ラインナップ

qPCRBIO SyGreen® Mix は、お使いの機器に合わせて以下のバリアントをご用意しています。いずれも 2x マスターミックスで、反応のセットアップ時にプライマー、テンプレート DNA、PCR グレードの水を追加するだけでお使いいただけます。

• qPCRBIO SyGreen® Mix Lo-ROX（112 nM ROX）
• qPCRBIO SyGreen® Mix Hi-ROX（1.12 µM ROX）
• qPCRBIO SyGreen® Mix with Fluorescein（0.2 mM フルオレセイン）
• qPCRBIO SyGreen® Mix Separate-ROX（ROX 非含有の No-ROX ミックス＋50 µM ROX 添加剤を別チューブで同梱）

※ サンプルをご希望の方はお問い合わせください。価格・マニュアル・MSDS 情報は各製品ページよりご確認いただけます。

推奨サーマルサイクリングプログラム

酵素を完全に活性化するため、ホット スタート段階を 95℃ で 2 分間行ってください。推奨される温度プロファイルは次のとおりです。

• 95℃（120 秒）
• 40 サイクル：95℃（5 ～ 15 秒）- 60℃（20 ～ 30 秒）
• 融解（Melt）

非特異的な生成物が得られる場合は、使用するプライマー セットに応じて、アニーリング/伸長温度を 60℃ から 65℃ に上げることをお勧めします。

染料ベースの qPCR または qPCR 全般に関する詳しい情報については、技術ガイドを参照してください。