qPCRBIO SyGreen® Blue Mix

qPCRBIO SyGreen® Blue Mix は、少量の反応物をロードする場合や白いプレートを使用する場合のエラーを減らすのに特に役立ちます。

アプリケーション

• 絶対的な定量化
• 相対的遺伝子発現解析
• ゲノム、cDNA、ウイルス配列からのハイスループットqPCR
• 極度にコピー数の少ないターゲットの検出
• 粗サンプルPCR

qPCRBIO SyGreen® Blue Mixとは？

qPCRBIO SyGreen® Blue Mix は、最適化を最小限またはまったく必要とせず、高速、高感度、再現性のある色素ベースのリアルタイム qPCR 用に設計されています。抗体媒介ホット スタート システムにより、プライマー ダイマーや非特異的な生成物の形成が防止され、反応の感度と特異性が大幅に向上します。

PCR Biosystems 社の Blue Mix には非反応性染料が含まれており、反応ミックスの可視性を向上させ、反応プレートのウェルでサンプルを視覚化できるため、リアルタイムPCRのパフォーマンスに影響を与えることなく、ピペッティングの精度が向上し、エラーが減少します。qPCRBIO SyGreen® Blue Mix は、ゲノム配列、cDNA 配列、ウイルス配列を含むあらゆる DNA テンプレートの定量に使用でき、コピー数が極めて低いターゲットを確実に検出できます。抗体を介したホットスタートシステムにより、プライマーダイマーと非特異的な生成物の形成が防止され、反応の感度と特異性が大幅に向上します。

この 2x ミックスでは、他の一般的な蛍光色素とは異なり、PCR を阻害しない独自のインターカレーション色素を使用しています。標準サイクリング条件での qPCRBIO SyGreen® Blue Mix の感度と一貫性を向上させるのと同じ開発により、高速および超高速サイクリング条件でも業界トップクラスのパフォーマンスを実現できます。

qPCR 選択ツールを使用して、どの ROX 変異体がお使いの機器と互換性があるかを調べることができます。

参考データ１：ガンマ アクチンの増幅

qPCRBIO SyGreen® Mix を使用したガンマ アクチンの増幅 (紫色の曲線)。増幅曲線は上部パネルに、融解曲線は中央パネルに、増幅効率は下部パネルに示されています。上部パネルで特定された競合製品 (灰色の曲線) との直接的なオンプレート比較が実行されました。マウス cDNA テンプレートの 5 段階希釈が、総反応容量 10 µL で使用されました。サイクリング条件は、各競合製品が推奨する条件でした。qPCRBIO SyGreen® Mix は、すべての競合製品と比較して、Ct が早く、融解ピークがきれいで、効率が優れています。

参考データ２：ベータ アクチンの増幅

qPCRBIO SyGreen® Mix を使用したベータ アクチンの増幅 (紫色の曲線)。増幅曲線は上部パネルに、融解曲線は中央パネルに、増幅効率は下部パネルに示されています。上部パネルで特定された競合製品 (灰色の曲線) との直接的なオンプレート比較が実行されました。マウス cDNA テンプレートの 5 段階希釈が、総反応容量 10 µL で使用されました。サイクリング条件は、各競合製品が推奨する条件でした。qPCRBIO SyGreen® Mix は、すべての競合製品と比較して、Ct が早く、融解ピークがきれいで、効率が優れています。

参考データ３：ベータ 2 ミクログロブリンの増幅

qPCRBIO SyGreen® Mix を使用したベータ 2 ミクログロブリンの増幅 (紫色の曲線)。増幅曲線はセット a とセット b の上部パネルに示され、融解曲線は中央のパネルに示され、増幅の効率は下部パネルに示されます。

各セットの上部パネル（灰色の曲線）で特定された競合製品と、プレート上で直接比較を行いました。マウス cDNA テンプレートの 5 段階希釈液が、総反応量 10 μL で使用されました。サイクリング条件は、各競合製品が推奨する条件でした。

qPCRBIO SyGreen® Mix は、競合他社の各ミックスと比較して、Ct が早く、融解ピークがより鮮明で、効率が優れています。

FAQs

サーマルサイクリングプログラムにおいて、95℃での最初のポリメラーゼ活性化ステップの時間を短縮できますか？

はい、qPCRBIO SyGreen® (Blue) Mix の 95 °C での活性化時間は 10 秒まで短縮できます。ほとんどのテンプレートの増幅には影響しません。ただし、特に難しい高 GC ターゲットを扱う場合は、マニュアルで推奨されている 2 ～ 3 分の活性化とテストして比較することをお勧めします。

qPCRBIO SyGreen® Blue Mix で生成された生成物は、消化、クローン化、およびシーケンスできますか？

はい、qPCRBIO SyGreen® Blue Mixes で生成された PCR 産物は、野生型 Taq ポリメラーゼで生成された PCR 産物と同じ特性を持っています。標準プロトコルを使用して、制限エンドヌクレアーゼで配列決定または消化することができます。産物は 3′-d(A) 末端で、TA クローニングに使用できます。また、クローニング前に平滑末端にしたり、制限酵素で消化したりすることもできます。最良の結果を得るには、標準的な PCR クリーンアップ キットを使用して PCR 産物を精製することをお勧めします。

ROX は反応に悪影響を及ぼす可能性がありますか？

ROX (6-carboxy-X-rhodamine) は、主にウェル間の光路のばらつきによって生じる蛍光レベルの変動を正規化するために、ROX 依存型リアルタイム PCR 機器でパッシブ リファレンス 色素として使用されます。蛍光強度 (Rn) の正規化は、リアルタイム PCR ソフトウェアで、特定の信号の発光強度を ROX の発光強度で割ることによって行われます。ROX は PCR 反応には関与せず、その蛍光レベルは各ウェルの DNA の量に比例しないため、この蛍光体をミックスに追加すると、増幅中に一定の蛍光信号が得られます。パッシブ リファレンス スタンダードを必要とするさまざまなタイプのリアルタイム PCR 機器では、主に各システムの光学構成 (つまり、使用される励起源と光学系の種類) が異なるため、ROX の最適濃度が異なります。

qPCRBIO SyGreen® Blue Mixes は、重硫酸塩に変換された gDNA テンプレートで機能しますか？

はい。重硫酸塩に変換した gDNA に qPCRBIO SyGreen® Mix をうまく使用したと報告したお客様がいます。

サンプル DNA を 1x TE (10 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA) バッファーに保存すると、qPCRBIO SyGreen® Blue Mix を使用した後続の qPCR と互換性がありますか？

はい、この保存バッファーは互換性があります。EDTA は混合物中のマグネシウムの一部をキレート化しますが、反応に大きく影響するほどではありません。

qPCRBIO SyGreen® Blue Mixes には SyGreen® 色素が含まれています。これは SYBR green ファミリーに属しますか？

SyGreen® は、SYBR™ Green と同じ非対称シアニン色素ファミリーに属しています。SyGreen® はこのファミリーの改良された新世代色素です。SYBR™ Green と同様に、SyGreen® は DNA に挿入されます。SYBR™ Green とは異なり、SyGreen® は広範囲の色素濃度で PCR 増幅をサポートします。つまり、色素は PCR 反応を阻害しません。これは、ヌクレオチド組成に偏りがないため、原核生物と真核生物のテンプレートの両方で堅牢で一貫性のある DNA 融解曲線を生成するのに役立ちます。

qPCRBIO SyGreen® Blue Mix の ROX 濃度はどれくらいですか？

パッシブリファレンス色素を含む qPCRBIO SyGreen® Mix は、異なる配合で提供され、それぞれ異なる濃度のパッシブリファレンス色素を含みます。qPCRBIO SyGreen Mix Lo-ROX には 112 nM ROX が、qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX には 1.12 µM ROX が、qPCRBIO SyGreen Mix Fluorescein には 0.2 mM のフルオレセインが含まれています。qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX 2x ミックスには ROX が含まれておらず、50 µM ROX 添加剤の別のチューブが含まれています。これにより、使用する ROX の濃度を選択できます。qPCR 選択ツールを使用して、どのミックスが qPCR マシンに最適かを確認できます。

SyGreen® を含むミックスの検出にはどのチャネルが適していますか？

SyGreen は FAM/SYBR チャネルで検出されるはずです。ご使用の機器が 2 つの色素の分離を可能にしている場合は、SYBR チャネルが推奨される場合があります。

qPCRBIO SyGreen® Blue Mix には何が含まれていますか？

qPCRBIO SyGreen® Mix は、すぐに使用できる qPCR 2x マスターミックスです。反応のセットアップ時にプライマー、テンプレート DNA、PCR グレードの水を追加するだけです。

ROX とは何ですか？ それは必要ですか？

ROX はパッシブリファレンス色素であり、PCR 反応には関与しません。PCR に関連しない蛍光の変動を標準化するために使用されます。「リソース」セクションの qPCR 選択ツールを使用して、どの qPCR ミックスがお使いの qPCR マシンに最適かを判断できます。

青い色素は何に使うのですか？

qPCRBIO SyGreen® Blue Mix には非反応性青色色素が含まれており、ピペッティング中に研究者を支援するために追加されています。PCR 反応の効率には影響しません。青色色素は蛍光シグナルをわずかに減少させる可能性がありますが、得られる Ct 値には影響しません。

qPCRBIO SyGreen® Blue Mixes で使用される HS Taq DNA ポリメラーゼのエラー率はどれくらいですか？

この酵素のエラー率は、取り込まれたヌクレオチド 2.0 x 10⁵ あたり約 1 個のエラーです。

qPCRBIO SyGreen® Blue Mixes の MgCl2 濃度はどれくらいですか？

すべての 4x qPCRBIO SyGreen® Blue Mixes には、6 mM の濃度で MgCl2 が含まれています。つまり、反応の最終濃度は 3 mM です。

ROX による信号の正規化が競合他社のミックスと比較して低いと思われる場合は、何を考慮する必要がありますか？

異なる機器には異なる ROX 濃度が必要なため、正しい濃度の ROX を使用していることを確認してください。たとえば、Lo-ROX ミックスを必要とする機器で qPCRBIO SyGreen® Blue Mix Hi-ROX を使用すると、ソフトウェアは qPCRBIO 信号を Hi-ROX レベルに対して正規化します。この場合、競合他社に Lo-ROX ミックスが選択されていたとすると、競合他社のミックスに比べて qPCRBIO ミックスの蛍光レベルが大幅に低下します。異なるメーカーのミックスを比較する場合は、データを分析する前に、別々に実行するか、パッシブ リファレンスをオフにすることをお勧めします。

標準希釈により増幅効率が低下した場合、どのようなトラブルシューティングが推奨されますか？

標準曲線の希釈度が上がると効率が低下することが報告されています。これを回避するには、標準を 10 mM Tris-HCl pH 8.0、0.1 mM EDTA、0.05% Tween-20 で希釈することをお勧めします。EDTA はキレート剤で、DNAse 活性を防ぐ役割を果たします。Tween-20 は界面活性剤であり、DNA がチューブの側面に吸着するのを防ぎます。ほとんどのマイクロ遠心分離機はポリプロピレン製で、DNA はポリプロピレンに非常によく付着することが研究で実証されています。標準物質は希釈後に凍結しないでください。界面活性剤の存在下であっても、凍結により DNA がポリプロピレンに不可逆的に結合するようです。標準物質を 4°C で保存し、数週間ごとに新しいバッチを準備することをお勧めします。

バックグラウンドシグナルが非常に高い場合、どのようなトラブルシューティングが推奨されますか？

蛍光のバックグラウンド レベルが高い場合、反応中のテンプレートが多すぎることが原因である可能性が高くなります。これは、テンプレート DNA に結合する SyGreen® 色素を検出する qPCR 機器に関連しています。サンプルには通常、ターゲット遺伝子以外の DNA が多く含まれているため、蛍光を検出するのに十分な量があります。この問題を解決するには、サンプルを 100 倍から 1000 倍に希釈することをお勧めします。これにより、バックグラウンドシグナルが減少するだけでなく、希釈によって Ct 値が標準で得られた値の範囲内になるため、正確な定量が可能になります。Ct が最初の標準よりも早い場合、公表できるほど正確な定量とは見なされないことに注意してください。

競合他社の製品と同じプライマーと PCR 条件を使用した場合に、非特異的な生成物が発生するのはなぜですか？

おそらく、最初のステップ (ホット スタート) の時間が短すぎることが原因です。酵素を完全に活性化するには、ホット スタート段階を 95°C で 2 分間行うようにしてください。推奨される温度プロファイルは、95°C (120 seconds)、40 cycles: 95°C (5-15 seconds) – 60°C (20-30 seconds)、Melt です。それでも非特異的な生成物が得られる場合、使用するプライマー セットに応じて、アニーリング/伸長温度を 60°C から 65°C に上げることをお勧めします。

qPCRBIO SyGreen® Blue Mix を使用すると、競合他社の製品と比較して Ct が早いのはなぜですか？

CT が早いということは、2 つのことのいずれかを示している可能性があります。1 つ目は、競合他社の製品に比べて当社製品のパフォーマンスが非常に優れていることの結果である可能性があります。PCR Biosystems 社は競合他社よりも高速になるように製品を設計しており、多くの製品よりも大幅に高速であることがわかりました。2 つ目は、非特異的な生成物によって引き起こされる可能性があります。これは、qPCR 実行の最後に融解分析を実行することで確認できます。結果に 1 つのピークが表示された場合は、正しい産物が増幅された可能性があります。結果に複数のピークが表示された場合は、反応が特異的ではありません。非特異的な生成物の問題に対処するには、サーマルサイクルを調整する必要があります。