IsoFast® Hot Start Bst Polymerase & Mixes

IsoFast® Hot Start Bst Polymerase & Mixes は、Geobacillus stearothermophilus（以前は Bacillus stearothermophilus、Bst として知られていた）DNA ポリメラーゼの大きなフラグメントの組換えバージョンです。5′-3′ ポリメラーゼ活性を保持するように設計されていますが、5′-3′ エキソヌクレアーゼ活性はありません。この酵素の強力な鎖置換能力により、標準的な PCR で必要とされる変性が不要になります。強力なホットスタート技術と組み合わせることで、プライマーダイマー形成と非特異的なターゲット増幅を最小限に抑えるこの新しい処方は、PCR ベース以外の増幅に最適です。

アプリケーション

• 全ゲノム増幅
• 多重変異増幅
• ローリングサークル増幅
• 等温増幅
• ループ介在等温増幅 (LAMP)
• 分子診断
• ポイントオブケア検査

IsoFast® Hot Start Bst Polymerase & Mixes とは？

IsoFast® Hot Start Bst Polymerase & Mix は、等温増幅技術の最新かつ改良された開発であり、DNA 増幅プロセスにおいて比類のない特異性と速度を実現し、分子診断と研究の要求を満たすように設計されています。ループ介在等温増幅 (LAMP) またはその他の等温増幅法のいずれであっても、IsoFast® Hot Start Bst Polymerase 2x Mix は、優れた感度と信頼性を保証します。PCR Biosystems 社の試薬は、ホットスタート Bst DNA ポリメラーゼ酵素の力を活用し、バックグラウンド増幅を最小限に抑え、ターゲット特異性を最大限に高めます。IsoFast® Hot Start を使用すると、等温増幅実験がこれまで以上に高速、効率的、かつ簡単になり、診断アプリケーションと研究の両方で分子生物学技術の新しい基準を確立します。

ホットスタートは、非特異的増幅や偽陽性結果の防止に役立つため、等温増幅技術において重要です。ループ介在等温増幅 (LAMP) などの等温増幅法では、特定のプライマーと酵素を使用して、通常 60℃ ～ 65℃ の一定温度でターゲット配列を増幅します。これらの技術は、分子診断や病原体検出など、さまざまな用途で広く使用されています。

等温増幅においてホットスタートが重要なのはなぜですか?

Bst ポリメラーゼ等温反応における非特異的増幅の防止

等温増幅では、増幅プロセスが特定の目的の配列のみをターゲットにしていることを確認することが重要です。非特異的増幅は、プライマーがテンプレートの意図しない領域に結合した場合、または増幅酵素が途中で増幅を開始した場合に発生する可能性があります。ホットスタート技術では、反応が目的の温度に達するまで増幅反応を抑制します。これにより温度が最適な増幅温度を下回っている反応の初期段階で非特異的産物が形成されるのを防ぎます。

Bst ポリメラーゼ等温増幅特異性の向上

ホットスタート法は、早期の増幅を防止することにより、等温増幅反応の特異性を高めます。つまり、反応によって非ターゲット配列が増幅される可能性が低くなり、偽陽性の結果のリスクが軽減されます。

Bst ポリメラーゼによる等温増幅感度の改善

ホットスタート技術は、等温増幅アッセイの感度も向上させます。非特異的増幅を最小限に抑えることで、利用可能な試薬の多くがターゲットシーケンスの増幅に確保され、反応の効率と検出限界が向上します。

参考データ１：IsoFast® Hot Start Bst Polymerase による速度の向上

IsoFast® Hot Start Bst Mix および IsoFast® Bst Mix を使用して、M13 バクテリオファージゲノムからスキャフォールドタンパク質遺伝子の M13 バクテリオファージ標的配列を等温増幅しました。プライマーミックスは、F3 および B3 プライマーの場合は 0.2 μM、FIP および BIP プライマーの場合は 1.6 μM、LoopF および LoopB プライマーの場合は 0.8 μM で構成されていました。総反応容量は 25 μL でした。M13 ssDNA ゲノムの 8 段階希釈液を使用しました。最初は 0.5 ng/μL のストックで、希釈係数は 10 で、これはプロットに示されているゲノムコピー数に対応しています。反応は 65 ℃ で 100 分間実行されました。BioRad CFX96 Touch を使用して、10 秒ごとに蛍光を記録しました。しきい値までの時間は、同じ蛍光しきい値に到達するまでに必要な時間を示します。

IsoFast® Hot Start Bst Mix は、IsoFast® Bst Mix と比較してより速い増幅を示します。

参考データ２：低温と常温の両方の設定でより高速な検出

IsoFast® Hot Start Bst Mix と NEB WarmStart LAMP キットを使用した、M13 バクテリオファージゲノムからのスキャフォールドタンパク質遺伝子のターゲット配列の等温増幅。プライマーミックスは、F3 および B3 プライマーの場合は 0.2 μM、FIP および BIP プライマーの場合は 1.6 μM、LoopF および LoopB プライマーの場合は 0.8 μM で構成されていました。総反応容量は 25 μL でした。M13 ssDNA ゲノムの 8 段階希釈を使用しました。0.5 ng/μL のストックから開始し、プロットに示されているゲノムコピー数に対応する 10 の希釈係数を使用しました。反応マスターミックスとプレートは、コールドブロック (コールドセットアップ) または室温 (アンビエントセットアップ) で約 20 分間準備しました。反応は 65 ℃ で 100 分間実行しました。BioRad CFX96 Touch を使用して 10 秒ごとに蛍光を記録しました。しきい値までの時間は、同じ蛍光しきい値に到達するまでに必要な時間を示します。

IsoFast® Hot Start Bst Mix は、低温設定と常温設定の両方で、NEB WarmStart LAMP キットと比較して増幅が速いことが示されています。

製品仕様

IsoFast® Hot Start Bst Polymerase

IsoFast® Hot Start Bst Polymerase with Dye

IsoFast® Hot Start Bst Mix

反応容量は 25 μL。到着後、製品は -30 ℃ ～ -20 ℃ で保管する必要があります。正しく保管すれば、キットは指定された有効期限まで完全な活性を維持します。

FAQs

IsoFast® Hot Start Bst で増幅した生成物を、クローニングやシーケンシングなどの下流アプリケーションで使用できますか？

等温増幅戦略の特定のタイプは、NGS の RCA (ローリングサークル増幅) や WGA (全ゲノム増幅) などの下流アプリケーションに適しています。このタイプの増幅には、IsoFast® Hot Start Bst を使用できます。ただし、最も一般的な等温増幅タイプである LAMP では、複数の種類の DNA 産物が生成されるため、クローニングには適さず、NGS アプリケーションには実用的ではありません。

IsoFast® Hot Start Bst ではどのような種類の核酸を増幅できますか？

IsoFast® Hot Start Bst Polymerase、IsoFast® Hot Start Bst Mix、IsoFast® Hot Start Bst Colour Mix、および IsoFast® Hot Start Bst Polymerase Colour はすべて、DNA および cDNA ターゲットの増幅用に設計されています。これらは RNA ターゲットの直接増幅には適していません。

RNA ターゲットを増幅するには、直接1ステップ等温増幅を行う IsoFast® Bst 1-Step Mix の使用をお勧めします。または、RNA を UltraScript® 試薬の1つを使用して cDNA に変換し、その後、ユーザーの好みの IsoFast® Hot Start Bst 試薬で cDNA を増幅する2ステップ形式をお勧めします。