Clara®HRM Mix

Clara® HRM Mix は、dNTP と MgCl2 を含むブレンドに、PCR BioSystems 社独自の超純粋な Taq DNA Polymerase が含まれています。PCR 阻害を大幅に軽減する当社の第 3 世代の DNA インターカレーション SyGreen® 2 色素を利用したこの新世代の高分解能溶融 qPCR マスターミックスは、正確な SNP 識別とメチル化の違いの定量化に優れたパフォーマンスを提供します。

アプリケーション

• SNP 遺伝子型解析
• 遺伝子検査
• CpGメチル化解析

HRMとは？

高解像度融解曲線 (High Resolution Melt) 分析は、二本鎖 DNA サンプルの変異、多型、エピジェネティックな差異の分析に使用される強力な手法です。この方法は、qPCR ターゲットの増幅後の変性と、ポリメラーゼ阻害を低減した第 3 世代 DNA インターカレーション色素 (SYBR Green 2、EvaGreen など) を組み合わせて分析します。HRM 分析では、融解曲線の形状と DNA 融解温度の違いを利用して、サンプル間の配列の変異を区別します。

通常、標準的な色素ベースの qPCR の後に実行される融解曲線分析では、蛍光データは 0.2 ～ 0.5 °C ごとに取得されますが、HRM 分析ではデータが 0.1 °C ごとにはるかに高い密度で取得されるため、得られる融解曲線の解像度がはるかに高くなります。これによりターゲット シーケンスの小さな違い (単一点変異、SNP、および塩基対メチル化まで) も、シフトした融解曲線として記録されます。したがって、HRM は、SNP 検出、対立遺伝子識別、またはターゲット バリアント検出のためのプローブベースの検出に代わる、より安価で効果的な代替手段を提供します。

SNPの検出

独自のスマート スクリーン技術により、優れた SNP 識別機能を保証する新しい組成の酵素バッファーの開発が可能になりました。Clara® HRM Mix を使用して、すべてのクラスの SNP を識別します。

• Class IV: A to T
• Class I: C to T and G to A
• Class II: C to A and G to T
• Class III: C to G

上図：Clara® HRM Mixを使用した4つのSNPの高解像度融解解析。A. OCA2 遺伝子の発現に関連する SNP rs12913832 (G/A)、B. C3 遺伝子の発現に関連する SNP rs2230199 (C/G)、C. DPYD 遺伝子の発現に関連する SNP rs641805 (A/T)、D. TP53 遺伝子の発現に関連する SNP rs9903378 (A/C)。反応には、各プライマー 0.4 μM とヒトゲノム DNA 5 ng が含まれます。サイクル条件は、95°C 2 分、続いて 95 °C 5 秒と 60 °C 20 秒の 45 サイクルでした。

Clara® HRM Mix では、超高感度の融解曲線分離により、クラス I からクラス IV の SNP を正確に区別できます。

メチル化分析

Clara® HRM Mix は、HRM qPCR と亜硫酸水素塩シーケンシングを組み合わせることで、ターゲット シーケンスの CpG メチル化を定量化するためにも使用できます。亜硫酸水素塩処理済みサンプルと、対応する未処理のコントロール サンプルを比較した HRM 分析により、ターゲットのシトシン メチル化率を推定できます。これは、亜硫酸水素塩処理後のメチル化シーケンスは、メチル化されていないターゲットと比較して CG 含有量が高くなるためです。

上図：HRM法によるFN3K遺伝子のDNAメチル化解析。異なるレベルのメチル化 (0%-100%) を持つヒトゲノム DNA は、qPCR 増幅の前に亜硫酸水素塩で処理されました。qPCR 反応には、各プライマー 0.4 μM とヒトゲノム DNA 5 ng を含む Clara® HRM Mix を使用しました。サイクル条件は、Roche Applied Science Lightcycler® 96 で、95°C 2 分、続いて 95 °C 15 秒、60 °C 20 秒、72 °C 10 秒の 45 サイクルでした。

Clara® HRM Mix を使用すると、DNA ターゲットの CpG メチル化を正確に推定できます。

参考データ：SNP rs12913832 のHRM分析

SNP rs12913832 のHRM分析: A. Clara® HRM Mix、B. qPCRBIO SyGreen® Mix、C. Thermo MeltDoctor HRM マスター ミックス、D. Bio-Rad Precision Melt スーパーミックス、E. Kapa HRM Fast qPCR キット、F. BioGire Defense LightScanner マスター ミックス、G. Qiagen Type-it HRM PCR キット、H. Roche LightCycler 480 高解像度融解マスター ミックス。Clara® HRM Mix 反応には、各プライマー 0.4 µM とヒトゲノム DNA 5 ng が含まれます。サイクル条件は、96℃ 2 分、続いて 95℃ 5 秒、60℃ 20 秒の 45 サイクルでした。その他はすべて製造元の指示に従います。

測定可能な機器の例

HRM 実験を実行するには、互換性のある機器が必要です。すべてのリアルタイム PCR 機器が HRM プロファイリングを実行するために必要な温度増加を実現できるわけではありません。次のメーカーの qPCR サーマルサイクラーのいずれかを使用することをお勧めします。（※ 2024年12月現在）

• Applied Biosystems: 7900, 7900HT, 7900HT FAST, StepOne, StepOne Plus, 7500, 7500 FAST, Viia7
• Bio-Rad: CFX96, CFX384
• BMS: Mic
• Eppendorf: Mastercycler ep realplex, Mastercycler realplex 2S
• Illumina: Eco
• Qiagen/Corbett: 6000, Q
• Roche Applied Science: Lightcycler 480, Lightcycler Nano