CALUX® レポーターアッセイ

BioDetection Systems（BDS社）は、人間の健康と環境を保護するためのメカニズムベースの超高感度生物学的モニタリングの開発と適用を専門としています。ハイスループットの CALUX® レポーターアッセイと補完的なテクノロジーの広範なパネルを含む、さまざまな独自の製品を提供しています。

BDS社の革新的な技術を使用すると、規制リスク評価に関連する主要な種類の毒性を迅速に評価でき、消費者の安全と信頼を保証できます。定量的生物分析と組み合わせた特別な後処理方法により、ダイオキシンや PFAS測定など、特定の化学クラスの正確な混合物影響評価が可能になります。

メカニズムに基づいた超高感度の in vitro バイオアッセイは、食品、水、環境、消費者製品の安全性と品質評価のための分析ツールとして、また化学物質の動物実験の代替手段として、最高の国際基準に従ってその使用を実施します。BDS社のアッセイは細胞および人間の生理学における主要な経路をターゲットとしているため、健康に有益な効果をもたらす化合物や化合物の混合物の発見にも使用できます。

BDS社のバイオアッセイ

BDS社は生物学的効果の特定と定量化、および効果に基づく化合物の検出を可能にするハイスループット対応の CALUX® レポーターアッセイの広範なパネルを提供しています。このアッセイは、細胞レベルでの特定の生物学的影響を高感度かつ正確に検出することを可能にし、健康に有益な効果をもたらす画分や化合物の特定に使用できます。ただし、これらの経路の状況依存的な抑制または過剰刺激が、化学物質の毒性効果の鍵となります。このようにして、このパネルを使用して、出生障害や生殖能力の欠損、がん、メタボリックシンドローム、肥満などの健康影響に関連する、感作、発がん、突然変異原性、生殖毒性や内分泌かく乱などの主要な化学的に誘発される毒性影響を予測することができます。

BDS社は、独自の CALUX® メソッドを社内サービスとしてだけでなく、ライセンスとしても提供しています。このため、専門的なトレーニングとサポートが利用可能です。標準製品や組織培養製品など、さまざまな製品がライセンス所有者に提供されています。

CALUX®アッセイの測定原理

哺乳動物細胞は、直面する化合物によって誘発されるシグナルやストレスに特異的に応答できる幅広い機構を備えています。CALUX®（Chemically Activated LUciferase eXpression）アッセイはこの自然な反応に加えて定量化可能な反応を生成するように改変された哺乳類細胞株のパネルを形成します。細胞が反応を生成するようにトリガーされると、レポーター遺伝子が活性化され、触媒反応中に光を生成する酵素（ルシフェラーゼ）が生成されます。この光信号はサンプル中の生物活性化学物質の量に比例します。CALUX®アッセイの分子設計により、観察される反応は、対象の効果に対して非常に特異的になります。

CALUX®アッセイの流れ

CALUX® アッセイは、単一化合物だけでなく複雑な混合物の試験にも使用できます。細胞はマイクロプレート（通常 96 または 384 ウェル）で培養されるため、スループットの向上と自動処理が可能になります。

続いて、それらを試験化合物の希釈系列、または試験サンプルの抽出物の希釈系列に曝露します。試験サンプルとともに、細胞は一連の濃度の参照化合物にも曝露されます。

一定の暴露時間の後ルミノメーターを使用して個々のウェルの発光を定量化します。試験化合物または試験サンプルによって誘発される活性は、その後、参照化合物の応答曲線における補間によって導出され、この参照化合物の等価物で表されます。

すべての CALUX®ベースのアッセイおよびその他のほとんどの細胞ベースのアッセイは、2 つの異なるモードで実行でき、アゴニストとアンタゴニストを区別できます。アンタゴニストモードでは、参照化合物との競合が評価されます。

代謝モジュール

すべてのCALUX®ベースのアッセイおよび他のほとんどの細胞ベースのアッセイは、追加の代謝分画を使用して実行することもできます。U2OSベースのCALUX®アッセイの場合、モジュールシステムをオプションで使用して、フェーズ I または II の代謝を個別にまたは一緒に含めることができ、特定の化合物（または混合物）が影響を受けやすい代謝経路に関する洞察が得られます。

CALUX®アッセイのターゲット

人間は通常、天然および合成の化学物質の複雑な混合物にさらされています。効果度に基づくバイオ分析は、これらの複雑な混合物の潜在的な危険性や利点について最も包括的な見解を提供します。しかしながら、規制は多くの場合特定の化合物のターゲット分析を要求しています。BDS社は、選択的抽出およびワークアップ方法と組み合わせた化合物クラス選択性定量バイオ分析を使用することで、これらの要求を橋渡しすることについて20年以上の経験を有しています。当社のサービスラボラトリーは、ダイオキシン、フラン、ダイオキシン様化合物、非ダイオキシン様PCB、およびエストロゲン様化合物の分析において、ISO 17025（登録番号RvA L401）の認定を受けており、更に新しい方法の開発が進められています。定量的かつ選択的なバイオ分析に加えて、最新の化学分析も提供しています。

ダイオキシン、フラン、ダイオキシン類似化合物
化学物質の安全性は、食品および飼料セクターにとって重要な課題であり、それは人間や動物の健康に直接影響を及ぼします。動物および公衆の健康保護のために、食品および飼料に含まれるダイオキシンに関する厳格なEU限度値が施行されています。DR CALUX®バイオアッセイを使用して食品および飼料中のダイオキシンを監視することで、規制限度値を超える可能性があると疑われるサンプルの（事前）選別が可能となります。様々な食品および飼料マトリックスにおけるアリール炭化水素受容体（AhR）ベースのDR CALUX®分析法によるダイオキシンおよびダイオキシン様化合物の分析は、ISO 17025認定（RvA L401）を受けており、カリフォルニア州水質委員会もAhRベースの分析による（再生）水中のダイオキシンの分析についてBDS社を認定しています。

ポリ塩化ビフェニル（PCB）
PCB（ポリ塩化ビフェニル）は、非常に毒性が高く、難分解性の産業用化学物質の一群であり、安全性評価において頻繁に扱われる化合物クラスです。PCBは、ダイオキシン様PCB（dl-PCB）と非ダイオキシン様PCB（ndl-PCB）の2つのグループに分けられます。ダイオキシン様PCBは、ダイオキシンと同様の毒性作用を示し、DR CALUX®分析法で測定することができます。非ダイオキシン様PCBも、EU規則に基づいて食品および飼料サンプルに対して規制されています。ダイオキシンやダイオキシン様化学物質とは異なり、非ダイオキシン様PCBは化学分析法（GC-MS/MS）を使用して分析されます。BDS社は、この方法についてもISO 17025認定（RvA L401）を取得しています。

多環芳香族炭化水素（PAH）
PAHs（多環芳香族炭化水素）は通常、複雑な混合物としてマトリックスに存在します。分析測定は、一般に存在が知られている数千のPAHsの中からごく限られたセットに焦点を当てます。PAH CALUX®法は、毒性を持ち発がん性のあるPAHsを検出するという利点があり、危険性の特定に非常に適しています。

ポリおよびパーフルオロアルキル化合物（PFAS）
PFAS（パーフルオロアルキル化合物）は、主な輸送タンパク質であるトランスサイレチン（TTR）による天然リガンドであるチロキシン（T4）の輸送を妨げるなどして、甲状腺ホルモン代謝に干渉することが知られています。PFAS CALUX®アッセイはこの重要な特性を利用して、化学混合物中のさまざまなPFAS化合物の影響を測定します。この方法は、構造に関する事前の知識に依存しません。T4によるTTR結合の妨害は、基準化合物であるPFOA（パーフルオロオクタン酸）と比較され、その結果がpg PFOA相当量/g処理サンプルとして表されます。シンプルなサンプル処理とクリーンアップが必要であり、これにより幅広いマトリックスへの適用が可能となります。

ステロイド
内因性ステロイドは、幅広い生理的プロセスの調節において重要な役割を果たしています。ステロイドは薬剤として広く使用されているほか、成長促進剤や運動能力向上剤として違法に使用されることもあります。また、ステロイドの残留物が食品や環境中に汚染物質として検出されることがあります。我々は、バイオアクティブステロイドを測定するための一連のアッセイを開発しました。特に交差反応を避けることに注意を払い、エストロゲン、アンドロゲン、プロゲスチン、およびグルココルチコイドの高選択的なアッセイパネルを提供しており、これが幅広い用途で有用であることが示されています。

環境エストロゲン
環境エストロゲンは、ステロイドホルモンであるエストロゲンの生物学的効果を模倣できる汚染物質であり、あるトリガー値を超えるレベルで存在すると、通常のエストロゲン作用を妨げることで、いわゆる内分泌かく乱物質として作用する可能性があります。CALUX® 分析によるエストロゲン化合物の検出および定量は、ISO 17025認定（RvA L401）を受けており、カリフォルニア州水質管理委員会によって再利用水中のエストロゲンのERαベース分析が承認されています。

分画技術
多くのサンプル、例えば食品、飼料、または環境由来のものは、複雑なバイオアクティブ化合物の混合物を含んでいます。BDS社では、複雑さを減少させるため、またはバックグラウンドとなる物質を除去するために、分析化学的分画技術を適用および開発しています。これには、固相抽出（SPE）、ゲル透析クロマトグラフィー（GPC）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が含まれます。多くのプロトコルは当社の研究所ですぐに実施可能ですが、新規または一般的でないマトリックスに対しては、特注のプロトコルを開発することも可能です。さらに、BDSは、効果度に基づく分析（EDA）を通じて複雑な混合物中のバイオアクティブな化合物を特定する経験を持っています。

CALUX®アッセイのアプリケーション

BDS社のアッセイと技術は標準サービスモードで使用されており、食品、水、環境、製品の安全性評価におけるさまざまな用途に適しています。また、動物実験の代替となるインビトロ法の開発と改善、新しい生物活性の発見、バイオベースおよび循環型経済におけるアプリケーションの促進を目的とした研究プロジェクトにも適しています。BDS社の製品およびアプリケーションの専門家が、お客様の特定のアプリケーションでのBDS社のツールとサービスの使用についてご相談に応じます。主なアプリケーションには、食品・飼料・水・環境・消費者製品の安全性評価、化粧品処方の動物実験代替試験、バイオベースおよび循環型経済のアプリケーション、人間の健康への影響評価、単一化学物質・有効成分の動物実験によらない安全性評価、健康に有益な物質のスクリーニングなどがあります。

検証ガイドライン

この分野での代替試験法を成功させるには、良好なin vivo効果の予測性が不可欠です。BDS社は、自社のアッセイの品質管理、検証、更に国際ガイドラインへの組み込みに大きな努力を費やしています。OECDおよびISOガイドラインがあり、BDS社はこれらの新しいアプローチが規制に対し承認が得られるよう積極的に取り組んでいます。これらのアプローチは、一般的に安全性評価における今後の進展と見なされています。当社のアッセイの優れた性能をサポートするための広範な参考文献が利用可能です。

CALUX®アッセイ

現在利用可能な CALUX®アッセイの概要を仕様表に示します。ほとんどのアッセイでは、アゴニストとアンタゴニストを区別するための手順と、モジュール式代謝モジュールが利用可能です。現在利用可能なCALUX® アッセイに加えて、BDS社は新しいレポーター細胞株とこれらの細胞株を使用した新しいアプリケーション、および関連するアプリケーションのための補完的なテクノロジーに常に取り組んでいます。CALUX®細胞株のライセンス契約についてはお問い合わせください。

スタンダード・組織培養製品・抽出および洗浄製品

マトリックスの参照材料は、抽出効率やアッセイのパフォーマンスの品質管理として分析に含まれます。BDS社の製品は、安定性があり、均一であり、よく特徴付けられており、飼料、魚油、卵粉などのマトリックスが利用可能です。参照化合物やキャリブレーション標準物質も提供しています。

組織培養製品として、CALUX®細胞の培養およびアッセイの実施に使用されるトリプシン、ライシスミックス、測定溶液、FCS（胎牛血清）および脱脂FCS、S9代謝酵素混合物を提供しています。提供するほとんどの製品は、CALUX®アッセイと組み合わせて低バックグラウンドと正確な機能を保証するためにCALUX®テストを受けています。

また、CALUX®バイオアッセイと併用する最適化された抽出・洗浄製品として、SPE（固相抽出）ベースの水抽出製品や、タンパク質結合阻害（TTR）カラムを提供しています。BDS社のクリーンアップカラムは、ダイオキシンのCALUX®分析のために最適化されており、高回収率で効果的なクリーンアップを迅速に実現します。