Air-Dryable Probe Mix and Probe 1-Step Mix

Air-Dryable Probe Mix と Probe 1-Step Mix は、RNA および DNA 配列の超高感度検出のための、多用途のオールインワン、空気乾燥可能な 4x qPCR および RT-qPCR 試薬ミックスです。

急速空気乾燥用に設計されたこれらの qPCR および RT-qPCR ミックスは、標準的な実験室用オーブンを使用した乾燥アッセイ形式を可能にし、凍結乾燥に代わるより簡単で高速かつ安価な代替手段を提供します。賦形剤の最適なブレンドにより、活性を失わずに信頼性の高い空気乾燥が保証されます。DNA のみを扱う場合は Air-Dryable Probe Mix を、DNA と RNA の両方のターゲットを効率的に検出する場合は Air-Dryable Probe 1-Step Mix を使用してください。

アプリケーション

• 診断プローブベースの qPCR と RT-qPCR
• DNA と RNA の検出
• TaqMan®、Scorpions®、およびモレキュラービーコンプローブ qPCR
• マルチプレックスおよびシングルプレックスのセットアップ

Air-Dryable Probe Mix and Probe 1-Step Mix とは？

Air-Dryable Probe Mix には、活性を失わずに確実に空気乾燥できるように、ホット スタート Taq ポリメラーゼ、dNTP、MgCl2、賦形剤のブレンドを含むグリセロールフリーの 4x qPCR ミックスが含まれています。マスター ミックスには、乾燥時の安定性を高めるために改良された UltraScript® 逆転写酵素の新しいバージョンと、RiboShield® RNase 阻害剤も含まれているため、最終的なブレンドは DNA の qPCR 検出と RNA ターゲットの検出のための 1 ステップ RT-qPCR の両方に適しています。

急速空気乾燥用に設計された Air-Dryable Probe 1-Step Mix は、体外診断キット開発 (IVD) での使用を目的としていますが、乾燥 (RT-)qPCR 反応の利点を活用したい方にも使用できます。空気乾燥プロトコルでは、凍結乾燥 (凍結乾燥) よりも大幅に時間と専門知識が節約でき、装置も非常にシンプルです。5 μL の 4x Air-Dryable Probe 1-Step Mix (最終反応量 20 μL に必要) は、標準的な実験室オーブンを使用して、わずか 80〜90 分でゲルに乾燥できます。

Air-Dryable Probe 1-Step Mix は、RNA または DNA の 1 ステップ プローブ ベースの RT-qPCR 検出のアッセイ セットアップを可能な限り簡単にするために、単一チューブ形式で提供されます。このミックスは、反応ミックスの空気乾燥用に特別に配合されており、乾燥前にプライマーとプローブを追加するだけで済みます。ミックスの再構成も同様に簡単で、サンプルと、オプションで水を追加するだけで、最終的な反応容量を作成できます。プレートをすばやくボルテックスすると、ゲルが完全に再構成されます。

空気乾燥の主なメリット

• 反応混合物の体積と質量が削減されるため、輸送と保管のコストが安くなります。
• 空気乾燥した最終ゲルは室温で安定しているため、コールドチェーン輸送や保管の必要がなくなります。これにより物流が簡素化され、全体的なコストが削減されます。
• 使用できるサンプル量を増やすことができます。サンプル投入量は最終反応量と等しくなります。これは、ターゲットコピー数が少ない希釈サンプルに最適です。
• オーブンでの自然乾燥は、専門的な機器や知識を必要としないため、非常に利用しやすい方法であり、追加のスタッフやプロジェクトの外注の必要がありません。
• 中小規模の IVD キット開発者向けの乾燥プロセスと最終製品開発の制御の向上。

参考データ１：マルチプレックスセットアップでの自然乾燥後の信頼性の高いパフォーマンス

Air-Dryable Probe 1-Step Mix を使用した、乾燥前 (青いバー) または乾燥後 (紫色のバー) のインフルエンザ A、インフルエンザ B、RS ウイルス、および SARS-CoV-2 のマルチプレックス増幅。Ct 値は左のパネルに、効率は右のパネルに示されています。RNA テンプレートの 5 つの連続希釈液が使用されました。これは、各ウイルスゲノムの 40,000、4,000、400、40、および 4 コピーに相当します。総反応容量は 20 μL でした。サイクル条件は、45 ℃ 20 分、95 ℃ 3 分、および 95 ℃ 15 秒、60 ℃ 30 秒の 50 サイクルでした。

参考データ２：37 ℃ で 12 週間インキュベート後の乾燥ゲルの安定性

Air-Dryable Probe 1-Step Mix を使用したシングルプレックスセットアップでの一般的なハウスキーピング遺伝子 (β-アクチン、γ-アクチン) の増幅。ミックスは乾燥され、-20 ℃ で保存されるか (青い曲線)、37 ℃ で 12 週間インキュベートされます (紫色の曲線)。増幅曲線は左のパネルに、効率は右のパネルに示されています。マウスの全 RNA テンプレートの 3 つの連続希釈液が使用されました。これは、5 ng/μL、500 pg/μL、および 50 pg/μL に相当します。総反応容量は 20 μL でした。サイクル条件は、45 ℃ 20 分、95 ℃ 3 分、および 95 ℃ 15 秒、58 ℃ 30 秒の 50 サイクルでした。

Air-Dryable Probe 1-Step Mix は、37 ℃ で 12 週間インキュベートした後でも、効率 (10% 未満の差)、速度 (1 Ct 未満の遅延)、感度に大きな低下は見られません。

参考データ３：シングルプレックスセットアップで空気乾燥した後の信頼性の高いパフォーマンス

Air-Dryable Probe 1-Step Mix を使用したシングルプレックスセットアップでの一般的なハウスキーピング遺伝子 (β-アクチン、γ-アクチン) の増幅 (乾燥前 (青い曲線) または乾燥後 (紫色の曲線))。増幅曲線は左のパネルに、効率は右のパネルに示されています。マウスの全 RNA テンプレートの 3 つの連続希釈液が使用されました (5 ng/µL、500 pg/µL、および 50 pg/µL に対応)。総反応容量は 20 uL でした。サイクル条件は、45℃ 20 分、95℃ 3 分、および 95℃ 15 秒、58℃ 30 秒の 50 サイクルでした。Air-Dryable Probe 1-Step mix は、乾燥後も効率、速度、感度に大きな損失はありません。

参考データ４：空気乾燥前と空気乾燥後のプローブ ミックスのパフォーマンスを比較

Air-Dryable Probe Mix を使用した cDNA ターゲットの二重増幅。一般的なハウスキーピング遺伝子 (β-アクチンおよびβ-2- ミクログロブリン [B2M]) の二重増幅を、空気乾燥前と空気乾燥後のプローブ ミックスのパフォーマンスを比較して行いました。マウス cDNA の 4 つの連続希釈液をテンプレートとして使用しました。これは、10 ng/µL、1 ng/µL、100 pg/µL、および 10 pg/µL に相当します。プライマー、プローブ、およびテンプレートは、湿った Air-Dryable Probe Mix と組み合わせるか、qPCR 反応用に適切な量の乾燥済み Air-Dryable Probe Mix を含むチューブに追加し、最終容量を 20 uL にしました。サイクル条件は、95℃で2分、続いて95℃で10秒、60℃で30秒を50サイクルで実行し、Air-Dryable Probe Mix では、マスターミックスの乾燥後も活性の低下や感度の低下は見られませんでした。

FAQ

乾燥条件を変えることはできますか？
製品マニュアルに記載されている乾燥条件は、当社のラボでテストされたサイクルの一例にすぎません。空気乾燥の場合、重量損失 (乾燥減量、LoD) が約 70〜75 % になることが重要です。これにより、乾燥ゲルに含まれる水分が 5〜10 % のみになります。乾燥時間は使用する器具によって異なります。特定のオーブンで初めてこの製品を使用する場合は、複数のチューブを使用して定期的に (60、70、80、90 分後など) LoD を測定し、最適なプロトコルを定義し、混合物 (オリゴの有無にかかわらず) および使用する乾燥機器に基づいて 74.5 ± 10.5 % または 70 ± 1 % の LoD を達成することをお勧めします。温度を変更することもできますが、当然ながら温度が低いほど時間がかかり、温度が高いと混合成分の完全性に影響を与えるリスクがあるため、予期しない問題が発生する可能性を最小限に抑えるために 40 ℃ を使用することをお勧めします。

このミックスを凍結乾燥してもよいでしょうか？
このミックスは凍結乾燥に成功しましたが、凍結乾燥はお勧めしません。賦形剤の含有量は空気乾燥用に最適化されているため、製品の凍結乾燥の安定性が大幅に低下します。このミックスは空気乾燥のみに使用することをお勧めし、凍結乾燥プロトコルには PCR Biosystems 社の Lyo-Ready 製品シリーズをお勧めします。

Air-Dryable Probe 1-Step Mix を DNA 検出に使用できますか？
もちろんです。これは PCR Biosystems 社初のユニバーサル オールインワン ミックスで、すでに RTase が含まれています。重要な点として、これは PCR Biosystems 社の HS Taq ポリメラーゼのパフォーマンスに影響を与えないため、RNA または DNA の両方をテンプレートとして使用できます。単一のマルチプレックス反応で RNA ターゲットと DNA ターゲットを同時に検出することはお勧めしません。

乾燥したゲルを再懸濁するにはどうすればいいですか？
各ウェルに 5〜6 μL のミックス (およびオリゴ) が乾燥している場合は、20 μL のテンプレートを水に溶かしてゲルを再懸濁するだけで十分です。再懸濁後、各ウェル内の溶液を均一にするために、密封したプレートを約 1 分間ボルテックスすることをお勧めします。

乾燥した反応ミックスはどのように保存すればよいですか？
乾燥したら、チューブ/プレートを密封します。このようにして、少なくとも 1.5 年間は室温で保存できます。長期保存の場合は、プレートをシリカゲル袋と一緒にジップロック袋に入れて保存することをお勧めします。

この製品は標準的な液体フォーマットの qPCR ミックスとどう違うのですか？
乾燥ミックスは湿潤ミックスと同様に動作し、蛍光の大幅な減少や増幅の遅延はありません。また、PCR Biosystems 社のすべての Probe 1-Step Mix と同じ感度と効率を示し、ウイルスゲノムのコピーを 4 つまで検出します。

乾燥ゲルはどれくらいの期間安定していますか？
乾燥したゲルを 37 ℃ で 3 か月間インキュベートしたところ、活性の顕著な低下は見られませんでした (つまり、蛍光プラトーの減少はなく、増幅の遅延は 1 Ct 未満でした)。

一度にいくつのターゲットを検出できますか (マルチプレックス反応)？
4 つのターゲットからなる 2 つの異なるセットを同時に増幅することに成功しました。外部ユーザーからは、より複雑なマルチプレックス反応の実行に成功したという報告があります。これに関するフィードバックや結果は、お問い合わせまでお知らせください。

乾燥前のミックスはどのように保管すればよいですか？
到着後、キットは -30℃〜-15℃ で保管してください。正しく保管されていれば、キットは 12 か月間完全な活性を維持します。

反応ミックスが乾きません。どうすればいいですか？
ミックスを乾燥するために使用される機器が正しくセットアップされ、電源に接続され、正しく動作していることを確認してください。また、乾燥時にウェルあたりのミックス（オリゴと ROX 色素を含む）が最大 5〜6 μL を超えないようにしてください。必ずマニュアルに記載されている指示に従ってください。最適な乾燥時間はオーブンによって異なります。マニュアルに記載されている指示に従って、必要に応じて反応の乾燥条件を最適化することをお勧めします。

乾燥できる最大量はどれくらいですか？
手順にかかる時間を最小限に抑えるため、できるだけ少量を使用することをお勧めします。つまり、4x ミックスの 5 μL のみを乾燥させることになります (20 μL の反応の場合)。プライマー、プローブ、および最終的には ROX (PCR 機器で必要な場合) をプロセス前に追加する場合は、4x ミックスにできるだけ少量を追加するために、高濃度のストック溶液を準備する必要があります。1 μL を超えないようにすることをお勧めします。量が多いと、乾燥後の製品に同じ割合の水分が残るように、乾燥時間が長くなり、LoD も高くなります。プライマーとプローブを含むミックスの 6 μL を乾燥する場合、LOD は 74.5 % ± 0.5 % である必要があり、そのためにはミックスを 40 ℃ で 80〜90 分間乾燥させることをお勧めします。

より多くの量を乾燥させたい場合はどうすればよいですか？
マニュアルに記載されている指示に従って、1 ウェルあたり 5〜6 μL を超える混合物 (およびオリゴ) を乾燥させることはお勧めしません。製造のスループットを高めるために、複数のプレートを同時に乾燥させることができます。大量の空気乾燥はお勧めしません。Lyo-Ready 製品シリーズを使用して凍結乾燥することをお勧めします。